噬菌体展示技术对免疫球蛋白结合分子结构与功能的系列研究.pdf

第一部分，目的：构建由噬菌体展示的免疫球蛋白结合蛋白的定点随机突变体组合文库，并应用各种类型免疫球蛋白对该组合文库进行体外亲和筛选，以获得各种具有不同结合特性的新的结合分子结构，同时也为研究与结合分子相互作用的分子机制打下基础。方法：应用的方法制备的结构域()，克隆于载体构建重组质粒。并应用含随机核苷酸序列()的引物，通过方法制备对的第、、、、和位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体片段。在突变体片段的’端引入个氨基酸大小()的随机连接肽，将片段随机连接，克隆于噬菌粒展示载体，转化大肠杆菌后辅助噬菌体拯救，构建由噬菌体展示的定点随机突变体组合文库。测定库容量、滴度，挑取单克隆进行序列测定，评价文库的随机性。应用人、分别对该噬菌体文库进行轮体外亲和筛选，结合实验监测筛选亲和力的变化，法监测筛选过程中各不同数目结构域组成的变化。结果：获得了库容量为&#;，滴度为&#;的噬菌体展示定点随机突变体组合文库，经测定该库在一级结构上具有较好的随机性和多样性。但在、亲和筛选过程中未获得阳性结合分子。结论：对的位氨基酸随机突变并引入个氨基酸大小随机连接肽，理论上包含的分子数目达到以上，为获得各种不同的免疫球蛋白结合分子，需要更大容量的噬菌体展示文库。但本实验的设计是对获得各种新型高特异性高亲和力结合分子的一次科学的探索，同时也为噬菌体展示技术在免疫球蛋白结合分子进化研究中的应用提供了新的可借鉴方法。第二部分，目的：应用噬菌体展示体外分子进化的方法，以结合抗原与不结合抗原的抗体对同一噬菌体展示免疫球蛋白结合分子组合文库进化筛选，观察所获得的敏感性代表序列是否不同。进一步检测这些序列与抗体结合抗原及不结合抗原时的结合活性，证明抗原结合是否能够引起抗体效应子(段)构象的改变，以及该构象改变对其结合特性的影响，从而阐明抗原结合对其效应功能的影响机制。方法：选用包含效应子结合蛋白的()、()结构域及的结构域()的单结构域随机组合文库，分别应用人与人抗阳性血清包被抗原对该组合文库进化筛选，比较分析各进化文库代表性序列的异同性。再以小鼠种单克隆抗体、、以及分别结合抗原后对该文库进化筛选，序列分析后选取代表性阳性单克隆，用法分别测定与种抗体结合抗原及不结合抗原状态下的结合活性，判断不同代表序列与不同状态抗体的结合是否存在倾向性的差别。结果：在人导向的筛选过程中，文库的展示序列全部进化为一天然细菌蛋白中不存在的新的结构形式；而在人抗阳性血清包被抗原的进化文库中％展示为、和结构，二者的代表性序列有显著差异。小鼠抗体的筛选也得到了结合抗原前后不同的优势进化序列，即未结合抗原的抗体进化文库的非天然结构形式、、(占％)和结合抗原的进化文库的结构形式、(占％)，测定这些不同序列分别与小鼠结合抗原及不结合抗原的种单抗的结合活性，结果显示由各自筛选所得的特异分布的序列与相同状态的抗体有着更强的结合反应。结论：本研究首次应用噬菌体展示技术研究抗原结合对抗体效应子构象的影响作用，证实了抗原结合确实能够引起抗体效应子构象的改变，并可对其结合特性产生影响。这一结论有助于阐明抗原结合引发抗体效应功能的一种新的机制，同时也为抗体的结构与功能的研究提供了一条新的途径。