新型鸭病毒性肝炎病毒

新型鸭病毒性肝炎病毒巢式检测方法的建立及应用报告人：王梓鸭病毒性肝炎鸭病毒性肝炎()是由鸭病毒性肝炎病毒()引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染性疾病。鸭病毒性肝炎在临床上以发病急、传播迅速、病程短、高死亡率为主要特征，该病主要侵害周龄以内的雏鸭口龄以内的雏鸭的死亡率高达%~%。的历史与分布鸭肝炎病毒()包括三个血清型，分别引起Ⅰ型Ⅱ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎。其中Ⅰ型鸭病毒性肝炎呈世界性分布。我国流行的鸭病毒性肝炎主要为Ⅰ型鸭病毒性肝炎，近年来陆续有新型鸭病毒性肝炎发现三个型之间无抗原相关性，没有交叉保护和交叉中和作用。最早发现是在年由在美国发现了Ⅰ型鸭病毒性肝炎。该病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法国、日本、美国和埃及等地流行、在我国广东、北京、浙江、福建、四川、安徽、广西、江苏、山东等地相继发生该病、目前几乎世界范围内主要养鸭地区均存在该病，给养鸭业带来了巨大的经济损失。Ⅱ型鸭病毒性肝炎是年首先爆发于英格兰诺福克鸭场，其他地区未见本病的报道。Ⅲ型鸭病毒性肝炎是年首次发现于美国纽约长岛地区。年，苏敬良等和黄安国等在北京和广西等地在～日龄疑似鸭肝炎的北京鸭和樱桃谷鸭上分离到两株与型和型无血清学交叉免疫反应的，认为出现了新的血清型，并将其命名为新型鸭肝炎病毒。新型鸭病毒性肝炎的基因组与型结构相似，但比型基因组稍大。同时，发现高变区主要存在于和基因、在基因上存在多个细胞抗原表位和细胞抗原表位，基因的变异致使不同血清型抗原性发生改变。的生物学特征年报道了型的全基因组序列，年报道了型变异株全基因组序列，为的研究做出了新的突破。与其他小病毒相比，基因组具有一些特殊的结构特征等建议将型归为小病毒科一个新的独立的属。等构建出了具有感染性的全长克隆，为进一步揭示基因组的结构和功能及防控该病提供了良好的技术平台。型基因组大小约为编码、具有一个较大的开放阅读框()，在基因组两端各有一段保守的非编码区型全基因组结构依次为:()()内含有病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点()型的己报道具有个茎环结构，’内含有病毒复制和翻译有关的()尾。型的’为，新型的’为，均具有典型的小病毒的基因组结构、型多聚蛋白具有个切割位点，且具有与小病毒相似的切割位点和保守基因序列。基因组编码区包含结构蛋白和非结构蛋白，分为种初级前体分子其中，前体蛋白裂解为组成病毒衣壳蛋白和，种结构蛋白。和构成病毒的非结构蛋白。编码和种非结构蛋白，编码和种非结构蛋白。非编码区型基因组‘长内含病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点()。在各病毒属不同血清型之间，小病毒元件的序列和二级结构具有保守性，是病毒存活所必需的。小病毒的分为个型，型的病毒包括肠道病毒属和鼻病毒属，心脏病毒属、口疮病毒属，双埃柯病毒属的属于型甲肝病毒属的属于型。通过对型的级结构预测表明，型的’可能含有型的颈环结构而没有型的三叶草结构，据此推断型的’区域会形成型的型的’长为，新型长，这在小病毒基因组中是最长的。有学者报道型的’形成了个发夹结构，参与病毒的复制，但它是否与宿主特异性有关还需进一步研究。病毒的’端()尾作为病毒的负链合成起始位点，其长度与负链的合成效率及病毒的感染能力有关。编码区包含一个大的，编码一个多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，从而分解成、和产物，、和又进一步分别分解为、型的多聚蛋白的切割位点预测的结果是:和的切割位点为：以及的切割位点为；的切割位点为。多聚蛋白水解产生的多肤数量主要由以下因素决定:()基因组是否存在蛋白。()是否水解为和。()蛋白的数量。其也是小病毒的基因组在不同的种属之间存在的差异所在。小病毒的基因组在不同的种属间虽然存在差异，但是在病毒复制过程中具有相似的功能、蛋白作为前导蛋白是蛋白酶，参与多聚蛋白早期切割和宿主蛋白的合成关闭蛋白作为宿主范围的决定因子蛋白是小病毒中的保守序列，与病毒合成相关蛋白与病毒毒力有关蛋白即，是共价结合于正链和负链’末端的蛋白引物蛋白构成大部分多聚蛋白，蛋白在病毒加工处理过程和复制中产生，具有水解多聚蛋白活性，并且具有一个半胱氨酸作为亲核作用的活性位点蛋白是依赖的聚合酶。结构蛋白:区编码病毒的壳体蛋白，包括基因，核苷酸序列全长、型的末端缺少基因序列，因此其末端可能未被十四烷基化，不被蛋白酶切割为和。试验证明，壳体蛋白含有多个类似于其他小病毒的核心结构，即八链反向平行β桶结构，与其相连的环形结构位于壳粒表面，这在免疫学中占有重要作用。型的与人肠道病毒()一样，一末端有一段残基丰富区延伸出来，长度约这段区域在中具有很强的免疫原性但它在型是否也具有同样的功能还未见报道。()基因:小病毒中蛋白作为主要的宿主保护蛋白，具有特异性抗原中和位点，蛋白多暴露于病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分，它能够诱导动物产生中和抗体。型与其他小病毒之间衣壳蛋白的氨基酸序列差异主要存在于的两端。何内娅通过对华南地区分离到的型和新型的氨基酸序列比对分析表明:包括了大部分的插入与缺失片段和高变异区，高变区主要分布在位，尤其是末端，存在点突变或连续变异。在第位，株新型毒株比株型多个氨基酸(和)。型和新型的蛋白不存在小病毒科保守的基序((())而型相应序列为，而新型为，这表明的病毒吸机制和复制能力存在差异还有待于进一研究。()基因:蛋白的末端具有免疫原性，的端以及连接β链的环，特别是ββ及β环的序列差异显著、何内娅通过对华南地区分离到的型和新型与参考毒株进行基因的变异分析，结果显示，型和新型的基因不同点在于:第三位型()→新型()，第位型()→新型()(除了台湾新型)，第位型()→新型()，第位型()→新型()，第位型()→新型()，第、位型()→新型()，第位～第位为型和新型变异最多处，第位型()→新型()，第到第位型和新型存在不连续的多位点不同，这些变异区是否影响型和新型的致病机理有待于进一步研究。非结构蛋白:()非结构蛋白:小病毒中，区长型推测具有多达种不同的蛋白，分别是和以及。的蛋白是小病毒多聚蛋白中的个新蛋白，由组成，可能参与病毒与宿主细胞之间相互作用，推测与病毒复制有关。蛋白由组成，含有个结构域。蛋白可能在控制细胞生长方面起作用，目前关于小病毒和蛋白的具体功能还不清楚。()非结构蛋白:区编码种非结构蛋白，分别是和。据报道，小病毒科的病毒蛋白与病毒毒力有关。蛋白包含个，这在小病毒中是最大的蛋白，并且与其他小病毒的蛋白序列一致性很低，的(亮氨酸)被小病毒基序中的(赖氨酸)所取代，但是该蛋白第位酪氨酸()残基却很保守，它在与基因组’末端尿嘧啶的附着过程中起重要作用。的蛋白酶是催化裂解小病毒多聚蛋白中非结构蛋白部分的关键酶，具有丝氨酸蛋白酶和半肤氨酸蛋白酶双重特性，病毒编码的蛋白酶完成多聚蛋白的大多数切割，通常发生在谷氨酞胺和甘氨酸之间的肤键()最终产生个终末产物。的蛋白是依赖的聚合酶()蛋白在病毒复制中起主导转录及复制作用。新型鸭病毒性肝炎病毒巢式检测方法的建立及应用近年来，在世界各地不断发生，其发病率和死亡率均呈上升趋势，养鸭比较集中的地区均遭受了巨大的经济损失和严重的威胁，由于新型鸭病毒性肝炎病毒()的存在，许多地区频频出现型鸭病毒性肝炎病毒()免疫鸭群暴发鸭肝炎的报道，严重制约了养鸭业的发展，不少学者己从发病鸭群中分离到工型鸭肝炎病毒的变异株(新型毒株)年，有学者先后证实新型也具有典型的基因组结构，但其与在序列上存在显著差异，且新型均不与产生交叉反应。因此，加强病原诊断技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义。本试验选取新型与传统工型差异序列区设计引物，建立了检测的逆转录巢式方法，旨在为新型鸭病毒性肝炎的早期诊断、流行病学调查等提供一种有效的分子生物学检测方法。材料和方法病毒、Ⅰ、鸭病毒性肠炎病毒()、鸭细小病毒()、新城疫病毒()、传染性法氏囊病毒()均由本实验室分离并保存。主要试剂、反转录酶、购自生工生物工程(上海)有限公司酶、克隆载体及其他限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。引物的设计与合成根据己发表的基因组序列，选取与差异序列区设计引物，利用生物学软件设计合成了对引物，引物序列如下:第轮扩增引物:上游引物:下游引物:‘第轮扩增引物:上游引物:下游引物:。病毒基因组的提取按试剂使用说明提取基因组，并提取其他几种病毒的或。反应反转录合成反转录反应按μ体系操作，反转录条件为℃作用后，℃灭活反应。反应最适模板用量的确立分别以μ反转录为模板，保持其他试剂浓度及反应条件不变，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳模板用量。反应最适引物用量的确立在μ反应体系中分别加入不同用量的引物，上下游引物()分别入μ对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳引物用量。反应最适退火温度的确立反应的退火温度分别取℃，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳退火温度。第轮扩增反应反应按μ体系进行，根据本试验确定的最适模板用量为μ，最适引物用量为μ，最适退火温度为℃，确定反应体系为:μ(μ)、μμ(）、上下游引物、（)各、μ，加水至μ。反应条件为:℃℃、℃、，℃、个循环℃。第轮扩增反应反应按μ，体系进行，模板为第轮产物μ，最适引物用量为μ，最适退火温度为℃，确定反应体系为:μ()、μμ()、上下游引物、()各μ，加水至μ。反应条件同扩增产物的检测及鉴定首先取扩增产物μ在二的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。然后用凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与克隆载体于℃过夜连接，转化感受态菌株α。挑取单个的转化菌落，加溶液培养后用质粒提取试剂盒抽提质粒，利用ⅠⅢ双酶切鉴定，阳性的克隆送生工公司进行测序鉴定。将测序结果与毒株序列进行同源性比较。特异性试验分别提取、Ⅰ、健康鸭肝组织的、的，用己建立的方法进行扩增。敏感性试验标准毒株提取后定量，然后倍梯度稀释提取的病毒基因组，使其分别相当于含有、、μ、、、、的含量，分别进行检测，确定其敏感性。在第轮中，利用上而不同的病毒浓度进行的产物μ为模板，进行巢式检测，反应程序不变，确定巢式的敏感性。重复性试验用建立的巢式检测方法，对、、、、、、健康鸭肝组织及检测为新型鸭病毒性肝炎阳性病料份和阴性病料份，重复检测次，以验证本方法的重复性和稳定性。初步应用—临床样品检测取疑似送检病料份，利用建立的检测方法进行检测，对扩增产物全部进行测序鉴定，并利用生物学软件进行序列分析。实验结果扩增产物的检测及鉴定扩增产物的检测扩增产物经过二琼脂糖凝胶电泳，第轮扩增产物在位于、处可见特异性扩增条带，与预期大小相符。：、：是对引物的空白对照：第轮扩增的产物：第轮扩增的产物克隆载体的酶切鉴定扩增产物连接到克隆载体上，根据病毒基因组的序列结构，利用Ⅰ和Ⅲ进行双酶切鉴定。：：第轮扩增产物重组质粒的Ⅰ和Ⅲ的双酶切产物扩增产物的测序鉴定挑取双酶切鉴定正确的阳性菌液送生工公司测序。测序结果表明，插入到载体的基因片段的核普酸序列为。特异性试验结果利用设计的第轮引物对扩增出了的目的基因片段，而Ⅰ、、健康鸭肝组织、均未扩增出目的片段(图)。取产物各μ为模板，利用第轮引物进行巢式检测，结果出现的扩增产物，而Ⅰ、、、健康鸭肝组织、均未扩增出目的片段(图)。第轮扩增的特异性试验：::Ⅰ:::健康鸭的肝组织（图）第轮扩增的特异性试验:::Ⅰ::健康鸭肝组织（图）敏感性试验结果种引物敏感性试验的产物取μ经二琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约附近出现特异性条带，与各自的预期产物大小相符。从结果可以看出第轮引物的检测灵敏度可以达到，而第轮引物的检测灵敏度可以达到。第轮扩增的敏感性试验：~：、μ、、、、第轮扩增的敏感性试验：~：、μ、、、、重复性试验结果经过次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定可靠的。临床样品检测结果用建立的巢式检测方法，共检测了份在不同地采集的鸭病料。检出阳性样品份，对阳性样品产物全部进行克隆与序列分析，结果均为。讨论由于在自然条件下感染成年鸭后，感染者可长期带毒和排毒而不出现临床症状，在这些情况下，病鸭组织中病毒含量较低，而且组织样品中因含有大量的蛋白和脂类等可能会影响扩增，将反转录产物直接用于扩增很难见到扩增片段。巢氏()是的一种改良模式，是指利用对引物进行轮扩增反应。首先对靶进行第步扩增，然后从第次反应产物中取出少量作为反应模板进行第次扩增，第次引物与第次反应产物的序列互补，第次扩增的产物即为目的产物。由于巢式反应有次扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性又有对引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。巢式技术通过反转录产物的和巢式的次扩增，首次反应产物的转移有助于稀释掉那些最初可能存在于样品中的抑制物，大大提高了检测的灵敏度，避免了样品检测过程中的假阴性问题。巢式技术具有敏感性高、特异性强、快速高效等特点，为鸭病毒型肝炎的早期诊断提供了新的模式。本试验参考中己发表和几株的基因组序列，经过多重序列比对分析。选取与序列变化差异明显区设计合成对新型鸭病毒性肝炎的特异性引物，建立了检测的巢式检测方法，该方法只对能够特异性地扩增出和的目的片段，而对、、、的扩增结果均为阴性，具有良好的特异性，该方法第次扩增的敏感性为，第次扩增的敏感性达到，敏感性提高了倍，具有良好的敏感性。在份临床样品的检测过程中，利用第轮检测出阳性样品份，而利用巢式检测时可以检出阳性样品份，将所有阳性样品的产物进行测序后，序列分析结果显示均是，说明建立的巢式检测方法更为敏感、特异，可以用于原始病料中的快速低含量检测，显示出了良好的应用前景。因此，本研究建立的巢式方法将为国内新型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查等提供一种简单快速的分子生物学诊断方法。鸭病毒性肝炎与鸭瘟鸭病毒性肝炎是引起雏鸭传播迅速和高度致死的传染病，病原为鸭肝炎病毒。鸭病毒性肝炎有种血清型，在我国流行的主要为型。一般多发于～周龄的雏鸭对成年鸭没有影响。对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和值的环境均有抵抗力。在℃加热分钟仍可存活，但加热至℃，分钟即被灭活。病毒在%福尔马林或%氢氧化钠中小时、在%漂白粉溶液中小时、%福尔马林℃，分钟均可使病毒灭活。鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的急性、高度死亡率的传染病，又称为鸭病毒性肠炎，俗称“大头瘟”鸭瘟病毒是疱疹病毒，病毒粒子呈球形。病毒对外界抵抗力不强。病毒对乙醚和氯仿敏感。病毒在值～时，经小时不减低毒力，在值和时，病毒迅速灭活。各种年龄和品种的鸭均可感染，但鸭瘟流行时，成年鸭发病和死亡较严重，月龄以下的雏鸭发病较少。本病于全年各季均可发生，但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通过消化道传播，也可通过交配、眼结膜和呼吸道而传播。鸭病毒性肝炎临床上主要表现为雏鸭突然发病，身体侧翻仰卧，头向后背双脚痉挛后蹬，角弓反张。主要病变在肝脏，肝脏肿大，质脆，色暗或发黄，肝脏表面有大小不等的出血点，胆囊肿胀呈长卵圆形，充满胆汁，胆汁呈褐色，淡茶色或淡绿色，脾有时见有肿大呈斑驳状。许多病例肾肿胀与充血。死亡率高达％以上。鸭瘟临床表现为精神不佳，食欲减少或停食，渴欲增加，喜卧不愿走动病初，体温升高到℃以上。流泪、眼周围羽毛粘湿，甚至有脓性分泌物，将眼睑粘连。鼻腔亦有分泌物，部分病例颈部肿大。病鸭下痢，排绿色或灰白色稀粪。剖检病变主要在消化道，食道黏膜有纵行排列的灰黄色假膜覆盖或小出血斑点，假膜易剥离，剥离后食道黏膜留有溃疡斑痕，这种病变具有特征性。泄殖腔黏膜有出血或溃疡，小肠有出血环，心脏有出血点，肝脏微肿胀、有大小不等的灰黄色或灰白色的坏死点鸭瘟患鸭以食道、泄殖腔和眼睑黏膜呈出血性溃疡和假膜为主要特征性病变，与患鸭病毒性肝炎完全不同。鸭病毒性肝炎患鸭肝脏有明显肿大并且有大小不等的出血点，而鸭瘟患鸭肝脏以灰黄色或灰白色的坏死点为主要症状。病理变化的区别防治措施鸭病毒性肝炎首先要加强饲养管理。引进健康雏鸭苗，月龄以内的雏鸭要隔离饲养，供给需要的维生素、矿物质，饮用自来水或深井水，不得饮用野生水禽栖息的水。用具要清洗、消毒。用鸭病毒性肝炎型弱毒疫苗进行免疫接种，成鸭于产蛋前半个月，肌肉注射~份只，产蛋中期，肌肉注射~头份只。雏鸭出壳后日龄或日龄皮下注射头份只。在疫区对雏鸡也可于~日龄皮下注射高免血清或卵黄）或康复鸭的血清，每只~毫升，可以预防感染或减少病死。一旦确诊可注射鸭病毒性肝炎卵黄抗体（或高免血清）进行治疗。预防鸭瘟要避免从疫区引进鸭，如必须引进，一定要经过严格检疫，并经隔离饲养星期以上，证明健康后才能合群饲养。还要禁止在鸭瘟流行区域和野水禽出没区域放牧。平时对禽场和工具进行定期消毒，被病毒污染的饲料要进行高温消毒，饮用水可用碘氯类消毒药消毒，工作人员的衣、帽等及饲养所用工具也要严格消毒。目前，该病的防制主要依靠疫苗，在受威胁区内，应注射鸭瘟弱毒疫苗。产蛋鸭适宜安排在停产期或开产前个月注射。肉鸭一般在日龄以上注射次即可。发生鸭瘟时应立即采取隔离和消毒措施，对鸭群用疫苗进行紧急预防接种，必要时剂量加倍，可降低发病率和死亡率。发现鸭群患鸭瘟时，按照实际情况向上级主管部门上报疫情、划定疫区，并立即采取封锁、隔离、消毒和紧急免疫接种等综合措施。集体病鸭发病，可采取隔离或扑杀方式处理。