柯萨奇病毒的rtpcr实验

属于小ＲＮＡ病毒科肠道病毒属，最易在灵长类动物细胞中生长。病毒分为Ａ、Ｂ两组。柯萨奇病毒Ａ组有２３个血清型，柯萨奇病毒Ｂ组有６个血清型。柯萨奇病毒单股正链，全长大约，病毒直径为～，球形，无包膜，病毒衣壳由等构成，呈面体立体对称。柯萨奇病毒(，)的诊断方法：病毒分离、动物接种操作烦琐成功率低影响诊断的敏感性；法检测患者血清中相应的特异性、抗体但不能获得有关病毒更多的信息；法既可以通过检测病人样本中的病毒来明确诊断也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序列为基因分型提供依据。两端为保守的非编码区，中间为编码区。’端共价结合一小分子蛋白质（约），与病毒合成和基因组装配有关；’端带有尾。编码区编码的病毒结构蛋白～，、和均暴露在病毒衣壳的表面，有中和抗原位点；位于衣壳内部，一旦病毒与受体结合后，即被释出，衣壳松动，病毒基因组脱壳穿入。逆转录，或者称反转录()，是聚合酶链式反应()的一种广泛应用的变形。在中，由一条单链转录为互补()称作“逆转录”，由依赖的聚合酶（逆转录酶）来完成。一条链被逆转录成为互补，再以此为模板通过进行扩增。()实验程序：标本的采集、标本的提取、引物、反应体系、温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定一步法：反转录在一个管子里完成，得到的全部产物都一起经扩增，灵敏度更高。两步法：反转录和分开，灵活而且严谨，但灵敏度不如前者高。操作注意事项全程戴手套灭菌、清洁的塑料管或无酶的玻璃制品高压带滤芯枪尖提取试剂要保证无酶所有试剂开盖时要标明日期在提取、和测序过程中使用无酶水操作快捷，提取后的应放在度备有冰盒，全程中保持在低温状态下避免反复冻融，防止降解。反应系统的组成：⑴耐热聚合酶（酶）：这是由耐热水生细菌体内提取的一种聚合酶。⑵模板：即待分析的目的，其长度不宜大于。⑶两种引物：为了保证聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板链的`端。⑷四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的。⑸缓冲溶液：保证聚合酶催化时所需的适当的溶液值技术类似于的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：①模板的变性：模板经加热至℃左右一定时间后，使模板双链或经扩增形成的双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板与引物的退火(复性)：模板经加热变性成单链后，温度降至℃左右，引物与模板单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：模板引物结合物在聚合酶的作用下，以为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板链互补的半保留复制链。重复循环变性退火延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需～分钟，～小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期()所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。注意事项关键环节①模板②引物③酶④循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板、杂质蛋白质；特别是染色体中的组蛋白；、酶抑制剂；、在提取制备模板时丢失过多；、模板核酸变性不彻底；、模板降解。的关键步骤是在的反转录，要求模版为完整的且不含、蛋白质等杂质。引物引物质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位②引物的浓度不仅要看值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。酶浓度：离子浓度对扩增效率影响很大，浓度过高可降低扩增的特异性，浓度过低则影响扩增产量甚至使扩增失败而不出扩增条带。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。物理原因变性对扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低扩增效率。出现片状拖带或涂抹带扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，浓度过高，浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：、减少酶量，或调换另一来源的酶；、减少的浓度。适当降低浓度。增加模板量，减少循环次数；、减少模板量。如何避免污染严格分区：标本处理区与扩增区、产物分析区，要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：体系配制→标本制备→扩增→产物分析→产物处理。试剂：引物和探针尽量分装，不要原瓶多次取用。加样：原则是模板最后加，其他试剂按照体积从大往小的加。操作多份样品时，制备反应混合液，先将、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。耗材：使用一次性吸头，严禁与产物分析室的吸头混用；产物：机器运行完后，取出产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。法提取核酸法检测柯萨奇病毒（两步法）逆转录（）聚合酶链反应（）产物的检测和鉴定引物：的基因引物法提取核酸）取病毒悬液加到离心管中，然后加入溶液，混匀秒后离心。）加入氯仿溶液，充分混匀秒钟）室温放置分钟后，，室温离心分钟）将上清液转移到一支新的离心管中）再加入异丙醇溶液，摇匀秒钟）室温静置至少分钟），℃离心分钟）倒掉上清液，加入冰冷的%乙醇），℃离心分钟）用吸尖小心吸出上清液倒掉）室温干燥后加入，℃保存逆转录（）配液：μ（μ）随机引物μ加水至μ混匀，瞬时离心，℃立即冰水浴，瞬时离心，依次添加下列试剂μμμμ加水至μ，混匀，瞬时离心，℃；℃；℃维持。于℃冰箱冻存。聚合酶链反应（）配液：体系()()